1.注意要點(diǎn)
（1）探針蛋白的本質(zhì)與相互作用蛋白的來源：探針蛋白的本質(zhì)：是全長蛋白、相互作用相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，甚至是化學(xué)合成的較小的生物活性片段。相互作用蛋白的來源：已知內(nèi)源性表達(dá)探針蛋白的細(xì)胞系是尋找與其相互作用蛋白的理想實(shí)驗(yàn)材料。
（2）細(xì)胞裂解物的制備：成功制備細(xì)胞粗提物的關(guān)鍵因素包括：細(xì)胞的裂解方式；pH的控制；溫度；避免蛋白的降解。這些都需要在預(yù)實(shí)驗(yàn)中多次重復(fù)來優(yōu)化細(xì)胞裂解條件。提取重組蛋白有時不必破碎細(xì)胞。例如，許多高表達(dá)的哺乳細(xì)胞系（尤其是中國倉鼠卵巢細(xì)胞，CHO細(xì)胞）和酵母細(xì)胞株（如Pichiapastoris）已經(jīng)被改造得可以分泌重組蛋白，因而可以直接從細(xì)胞條件培養(yǎng)基和培養(yǎng)濾出液中純化重組蛋白。使用這些方法很重要的一點(diǎn)是要盡可能快地濃縮大量的細(xì)胞條件培養(yǎng)基，使之盡快進(jìn)入“無蛋白酶的環(huán)境”。
2.疑難分析解答
（1）結(jié)合過程中的參數(shù)：發(fā)現(xiàn)和證實(shí)蛋白質(zhì)的相互作用，與這些蛋白質(zhì)在自然狀態(tài)下相互作用的穩(wěn)定程度密切相關(guān)。這種穩(wěn)定程度決定了我們采用什么樣的體外結(jié)合條件。在自然狀態(tài)下那些參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)相互作用往往是極其穩(wěn)定的，而在酶作用或蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程中出現(xiàn)的蛋白質(zhì)相互作用卻短暫而不穩(wěn)定。
穩(wěn)定的蛋白質(zhì)相互作用能夠在較長的時間中仍保持相互作用關(guān)系，是zui容易用GST沉降實(shí)驗(yàn)證實(shí)或發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)相互作用。對于這些較強(qiáng)的蛋白質(zhì)相互作用我們可以在較廣泛的結(jié)合條件下都能夠得到結(jié)果，往往我們常選用強(qiáng)離子濃度的緩沖體系避免非特異的蛋白質(zhì)相互作用，從而降低假陽性的出現(xiàn)。如果蛋白復(fù)合體相互作用較弱，具有較高的解離常數(shù)，那么我們常通過pH、離子強(qiáng)度以及不同的緩沖體系來調(diào)整蛋白質(zhì)的體外相互作用體系。
用GST沉降實(shí)驗(yàn)來證實(shí)和探索自然中短暫而弱的蛋白質(zhì)相互作用，則是一項較為困難的實(shí)驗(yàn)。這種蛋白質(zhì)的相互作用往往很難用GST沉降實(shí)驗(yàn)類似的方法來完成。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)過程這種蛋白質(zhì)相互作用很可能就發(fā)生了解離。而這種短暫而弱的相互作用往往發(fā)生在酶發(fā)揮活性和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，在這些過程中常需要其他輔助因子的存在以及能量的參與（如NTP的水解產(chǎn)生的能量）。因此，要用GST沉降實(shí)驗(yàn)完成短暫而弱的蛋白質(zhì)相互作用分析，就應(yīng)該在反應(yīng)體系中加入恰當(dāng)?shù)妮o助因子以及能量，模擬一個和自然狀態(tài)很接近的相互作用體系。
（2）蛋白復(fù)合物的洗脫
在鑒定誘餌蛋白和靶蛋白過程中，需要將蛋白復(fù)合物從標(biāo)簽蛋白發(fā)揮親和作用的基質(zhì)上洗脫下來，SDS-PAGE的上樣緩沖液和標(biāo)簽蛋白的競爭物都能夠作為洗脫工作液。SDS-PAGE的上樣緩沖液作為洗脫工作液往往具有更強(qiáng)的洗脫能力，但是也會導(dǎo)致蛋白復(fù)合物的變性。另外，上樣緩沖液可以從基質(zhì)上洗脫下能和親和基質(zhì)發(fā)生強(qiáng)相互作用的非特異結(jié)合蛋白質(zhì)以及導(dǎo)致基質(zhì)的脫落，這些都會影響后續(xù)的鑒定分析。而標(biāo)簽蛋白競爭性洗脫工作液，能夠特異的洗脫下誘餌蛋白-靶蛋白復(fù)合物，而且還是一種非變性的洗脫方法，能夠保持蛋白質(zhì)復(fù)合體的自然空間狀態(tài)，有利于某些隨后的分析。
另外一種洗脫方法能夠選擇的將靶蛋白洗脫下來，而保持誘餌蛋白仍和親和基質(zhì)相連。這種方法常采用步進(jìn)式的增強(qiáng)鹽離子濃度或降低pH。這種方法也是一種蛋白質(zhì)非失活的洗脫方法，同時還能夠提供蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)弱的相關(guān)消息。細(xì)胞
（3）沉降實(shí)驗(yàn)中對照的設(shè)立
在所有沉降實(shí)驗(yàn)中對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)立都是必須的。在陰性對照實(shí)驗(yàn)中只加入親和基質(zhì)和靶蛋白混合液，而不加誘餌蛋白，從而能夠幫助排除和親和基質(zhì)發(fā)生非特異結(jié)合的假陽性。在另一組陰性對照實(shí)驗(yàn)組中，只有親和基質(zhì)、誘餌蛋白和無靶蛋白的蛋白混合液，從而能夠幫助排除和誘餌蛋白中的標(biāo)簽蛋白非特異結(jié)合的假陽性，這一組對照實(shí)驗(yàn)組也能夠作為陽性對照，說明親和基質(zhì)能夠有效的捕捉帶標(biāo)簽的融合誘餌蛋白。
在線客服
