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人游離原卟啉(FEP)試劑盒實驗檢測
更新時間:2015-03-25   點擊次數(shù):624次

人游離原卟啉(FEP)試劑盒實驗檢測

本試劑僅供研究使用     

試驗原理:
人游離原卟啉FEP試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知FEP濃度的標(biāo)準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進行檢測。先將FEP和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中FEP的濃度呈比例關(guān)系。

操作注意事項

1.試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準品應(yīng)丟棄,不可保存。
2.實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。
3.不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4.使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
5.使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6.洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
7.底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8.加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9.按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法
1、血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、人游離原卟啉FEP血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液
5、保存------如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
1.標(biāo)準品:標(biāo)準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標(biāo)準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:
32 umol/L    (6號標(biāo)準品)    原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
16 umol/L    (5號標(biāo)準品)    100ul的原倍標(biāo)準品加入100ul的標(biāo)準品稀釋液
8.0 umol/L    (4號標(biāo)準品)    100ul的5號標(biāo)準品加入100ul的標(biāo)準品稀釋液
4.0 umol/L    (3號標(biāo)準品)    100ul的4號標(biāo)準品加入100ul的標(biāo)準品稀釋液
2.0 umol/L    (2號標(biāo)準品)    100ul的3號標(biāo)準品加入100ul的標(biāo)準品稀釋液
1.0 umol/L    (1號標(biāo)準品)    100ul的2號標(biāo)準品加入100ul的標(biāo)準品稀釋液
0 umol/L    (空白對照)    原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2.洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟
1.使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
2.根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
3.加入稀釋好后的標(biāo)準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
4.甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
5.每孔加入60ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
6.甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
7.每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
8.取出酶標(biāo)板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9.在450nm波長處測定各孔的OD值。

試劑盒性能
1. 靈敏度:人游離原卟啉FEPzui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性:不與其它細胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

結(jié) 果 判 斷 與 分 析
1、儀器值:于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的FEP標(biāo)準品濃度為橫坐標(biāo)(X),做得相應(yīng)的曲線,樣品的FEP含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

3、檢測值范圍:0-32umol/L

4、敏感度: 0.1 umol/L

 

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